跑电泳时的注意事项

跑电泳时的注意事项 | 时间: May-23 16:40:52 | 分类:技术栏目

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    影响电泳分离的主要因素:

1. 待分离生物大分子的性质:待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和 性质都会对电泳有明显影响。一般来说,子带的电荷量越大、直径越小、形状 越接近球形,则其电泳迁移速度越快。
2. 缓冲液的性质:缓冲液的 pH 值会影响待分离生物大分子的解离程度, 从而对其带电性质产生影响,溶液 pH 值距离其等电点愈远,其所带净电荷量 就越大,电泳的速度也就越大,尤其对于蛋白质等两性分子,缓冲液 pH 还会 影响到其电泳方向,当缓冲液 pH 大于蛋白质分子的等电点,蛋白质分子带负 电荷, 其电泳的方向是指向正极。 为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电 荷以及缓冲液 pH 值的稳定性, 缓冲液通常要保持一定的离子强度, 一般在 0.02 -0.2,离子强度过低,则缓冲能力差,但如果离子强度过高,会在待分离分 子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛) ,由于离子氛与待分 离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因而引起电泳速度降低。 另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
3. 电场强度:电场强度(V/cm)是每厘米的电位降,也称电位梯度。电 场强度越大, 电泳速度越快。 但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大, 而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功(W)为:W=I2.R.t 式中:I 为电流强度,R 为电阻,t 为电泳时间。 电流所作的功绝大部分都转换为热, 因而引起介质温度升高, 这会造成很 多影响: 1、 样品和缓冲离子扩散速度增加,引起样品分离带的加宽; 2、 产生对流,引起待分离物的混合; 3、 如果样品对热敏感,会引起蛋白变性; 4、 引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周 散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起中央 部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,由于 中央部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度, 可以减小生热, 但会延长电泳时间, 引起待分离生物大分子扩散的增加而影响 分离效果。 所以电泳实验中要选择适当的电场强度, 同时可以适当冷却降低温 度以获得较好的分离效果。
4. 电渗:液体在电场中,对于固体支持介质的相对移动,称为电渗现象。 由于支持介质表面可能会存在一些带电基团, 如滤纸表面通常有一些羧基, 琼 脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有 Si-OH 基团等等。这些基团电 离后会使支持介质表面带电, 吸附一些带相反电荷的离子, 在电场的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电渗。在 pH 值高于 3 时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带 正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。如果 电渗方向与待分离分子电泳方向相同,则加快电泳速度;如果相反,则降低电 泳速度。
5. 支持介质的筛孔: 支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度 有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。
关于胶回收切胶的一点注意事项:
1. 电泳的 buffer 和 gel 都是新制的, 切胶的台子清理干净, 刀片最好洗净灭菌, 总之一句话就是保证切下的带没有外源 dna 污染。
2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积,可以 用相对比较薄的胶来做,只要够点样即可,也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3. 关于防护,在一般有机玻璃后就足够了,戴上防护面具以保护眼睛,如果戴 树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射,或者对于胶有特殊要求,例如要 求不含 EB, 可以采用点 marker 和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条 带在胶上的位置进行切胶。   4. 按照正常程序点 marker 跑胶,然后切下有 marker 的胶,EB 染色,紫外灯 下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与 marker 间的相对位置已知, 根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。 如果觉得很难判断, 可以直接 在 marker 边点少量的样,这样位置就容易确定了。

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